MIT Molecular Biology 笔记4 DNA相关实验
2024-10-09 05:41:43
视频 https://www.bilibili.com/video/av7973580?from=search&seid=16993146754254492690
教材 Molecular biology of the gene 7th edition J.D. Watson et. al
DNA复制相关实验
一、
1、聚合酶活力测定 掺入法
膜结合法
1）DNA聚合酶以标记的dNTP为底物反应
2）分离dNTP
- 硝酸纤维素滤膜（带正电）
- 点样
- 缓冲溶液洗脱dNTP
- 50mmol·L-1 NaCl （离子交换的原理？）
- （2-3molL-1 才能洗DNA）
- 看DNA上有没有标记核苷酸掺入
缺点：不能定量，可以看看提取液有没有聚合酶
电泳分离法
- 变性胶
- 琼脂糖agarose + NaOH
- 聚丙烯酰胺 + 尿素
- 辅以加热让DNA变性
- 只标记引物
- 引物延长实验
- 避免每个核苷酸被标记
2、聚合酶持续合成能力测定
模板竞争分析
- 实验分两组
- 制备两种引物模板接头（PTJ），一种标记，一种不标记
- 每组加入两倍聚合酶
- 加入没标记dNTP + 1000x 没标记PTJ
- 足够时间反应
聚合酶从标记PTJ掉落后，很难再结合上标记的PTJ，因为没标记的PTJ有1000倍之多
电泳分析标记的合成产物的长度，即可得知酶的持续合成能力
3、解旋酶的测定
assay for helicase
- 本胶应非变性胶
- 如想看到所有DNA 溴乙锭染色
- 为何低盐助变性：高盐高电解质强度，掩盖了DNA双链负电。低盐，负电互斥
assay for helices polarity
用限制酶切段双链部分
4、拓扑异构酶的测定
assay for topoisomerase
supercoil 泳动速度快
区分 type1 type2:
- kDNA 连环索烃：短膜虫质粒
看relex的速度 1慢 2快
5、核小体定位实验
Assay： 定位核小体实验
微球菌核酸酶MNase ：双链内切酶，非序列特异
连接dna的长度会有物种差异，但是盘绕核小体的长度都是一样的
Assay： MNase-seq 可以知道位置
1.深度消化 只剩147bp
2.电泳纯化
3.两端深度测序 ？？
4.沿染色体定位
细胞周期任何时机都可以做此实验
通过核小体的限制，让复制、转录蛋白结合在正确位置
二、
1、错配修复分析
根据限制酶切割位点专一性
2、甲基化的检测
如下几种酶对不同甲基化程度位点的切割效率不同
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